新型荧光探针实时跟踪活细胞内Ras蛋白活性
分析化学
作者：X-MOL
2022-11-02
Ras是肿瘤中最常见的突变基因之一，大约三分之一的肿瘤携带Ras变异。Ras蛋白属于小G蛋白鸟苷酸三磷酸酶（small GTPase）家族，受鸟嘌呤交换因子（GEF）和GTPase激活蛋白（GAP）的调控,并通过结合GTP或GDP激活或失活。Ras像开关一样控制下游关键的细胞生长和增殖的信号传导通路。Ras在癌症细胞里的某些变异导致它被锁定在GTP结合的激活状态，过度刺激下游通路，进而促进肿瘤细胞增殖、成活和转移。数十年来靶向Ras并抑制其活性一直是癌症治疗的重点研究方向。尤其是自2013年起，关于KRas-G12C抑制剂的开创性工作促使靶向Ras的药物研发进入爆发期。检验和捕捉活细胞内Ras活性变化将大大促进靶向Ras药物的开发。此外，Ras的三种重要亚型，KRas、NRas和HRas，都与多种癌症相关。三种亚型具有不同的翻译后脂质修饰和膜定位，以及不同的细胞内功能。了解Ras亚型在细胞内的信号调控不仅能帮助我们进一步理解上游信号是如何精准调控不同Ras亚型在细胞内的活性和功能，而且还能帮助我们基于药物在活细胞原生环境下对Ras的影响，更准确地评估靶向药物的特性。
目前常用的检测细胞内Ras活性的方法是利用Ras结合蛋白Raf1的结构域从细胞裂解物中富集结合GTP的Ras,再通过Ras抗体的免疫印迹法来定量。由于使用细胞裂解液，这种方法既无法准确地探测和捕捉到特定膜定位的Ras活性及其变化，也很难拓展为高通量筛选分析来开发药物。能否实现在活细胞内检测Ras活性变化，甚至是不同膜定位的Ras活性呢？
在活细胞内跟踪Ras活性无疑是一项非常重要却很有挑战性的工作。对此，美国加利福利亚大学圣地亚哥分校张瑾教授（点击查看介绍）及其科研团队近期取得了关键进展。他们设计和开发了一种新型的基于Förster 共振能量转移（FRET）的荧光探针RasAR，实现了在活细胞内检测不同膜定位的Ras活性随时间的变化。RasAR探针的设计利用Raf1选择性结合活化的Ras这一特点，通过分子设计选择了Ras与Raf结合域（RBD）的一小段氨基酸序列作为假配体（pseudoligand），并在假配体与Raf结合域的两侧连有一对荧光蛋白。当Ras被激活时，活化的Ras将与假配体竞争结合Raf结合域（RBD）,引起与其相连的荧光蛋白供体和受体耦合角度及相对距离的变化，进而使荧光共振能量转移的效率发生变化。因此，测量荧光共振能量转移的变化则反映了细胞内Ras的活性。通过活细胞成像，RasAR首次实现了直接检测细胞内Ras活性，并且可以特异和灵敏地检测和跟踪不同Ras亚型的活性变化；同时，由于RasAR是可遗传编码的，RasAR可以定位到各种亚细胞结构来跟踪不同膜定位的Ras活性，来分析不同的信号调控。例如，他们发现Src激酶特异性地抑制高尔基体上的HRas。此外，他们还利用RasAR跟踪多个KRasG12C抑制剂对活细胞内Ras活性抑制的动态变化。
图1. 荧光探针RasAR用于实时跟踪活细胞内Ras活性
开发Ras靶向药物依赖于对癌细胞内Ras介导的从上游信号（如生长因子）到下游通路（如Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt、Ral GEF）的信号传导网络有更深刻和更全面的理解。例如细胞是如何精准调控Ras亚型的活性和亚细胞定位？亚型的膜定位对应的功能是什么和它们之间的联系是什么？不同Ras突变又有什么样的影响？需要进一步的研究来探明Ras在癌症中的机制，探索癌症的精准化治疗和潜在的联合治疗。在这些方方面面，RasAR都有望帮我们洞察这一靶点的特殊调控和促进新药研发。
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Fluorescent Biosensor for Measuring Ras Activity in Living Cells
Ryan Weeks, Xin Zhou, Tina L. Yuan, and Jin Zhang*
J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 17432–17440, DOI: 10.1021/jacs.2c05203
导师介绍
张瑾，美国加利福利亚大学圣地亚哥分校（UCSD）药理系,化学和生化系，生物医学工程系教授。1995年毕业于清华大学，2000年师从美国芝加哥大学David G. Lynn取得博士学位，2000年至2003年在美国加利福利亚大学圣地亚哥分校（UCSD）钱永健（Roger Y. Tsien）和苏珊泰勒（Susan S. Taylor）的实验室开展博士后研究。之后她作为助理教授加入约翰霍普金斯大学医学院的药理学和分子科学系，并于2013年擢升为正教授。2015年她带着她的团队回到美国加利福利亚大学圣地亚哥分校（UCSD）并任职至今。她是加利福利亚大学圣地亚哥分校(UCSD)生物光学探针发展中心的主任和联合创始人，Cell Chemical Biology的编辑委员会成员。
研究领域为细胞信号传导调控的分子机理与细胞机理。综合应用生物化学，细胞生物学，生物物理学，及化学生物学等多种技术方法，包括基因编码的基于荧光蛋白的生物探针，超分辨率成像技术，研究活细胞内的信号传导分子的动态变化，揭示疾病状态下信号转导调控的机制。发表许多论文和获得很多荣誉和奖项。详情见https://en.wikipedia.org/wiki/Jin_Zhang_(biochemist)
https://www.x-mol.com/groups/zhang_jin